Enfant, il est devenu aveugle, ce qui ne l'a pas empêché de faire une brillante carrière musicale. En 1526, il fut organiste de la chapelle musicale de l'impératrice Isabelle du Portugal et, en 1538, il entra au service de l'empereur Charles Ier comme organiste de sa chapelle castillane, où il dut contacter les chanteurs de la chapelle flamande de l'empereur et faire connaître avec eux les œuvres de Philippe Verdelot, Thomas Crecquillon, Clément Janequin, Clemens non Papa et surtout Josquin des Prés.
Entre 1548 et 1551, il accompagne Philippe II dans ses voyages à Milan, Naples, en Allemagne et aux Pays-Bas. Puis (1554-1555) il accompagna le prince à Londres pour son mariage avec Maria Tudor, occasion à laquelle est attribuée l'influence du musicien espagnol dans le style de la musique pour clavier anglaise de la fin de son siècle. Considéré comme l'un des plus grands claviéristes et compositeurs de son temps, son œuvre est écrite de préférence pour son instrument, l'orgue, bien qu'il ait déjà été joué en son temps avec d'autres instruments et même avec des ensembles instrumentaux. Luis Venegas de Henestrosa (Libro de Cifra Nueva) et surtout son fils Hernando de Cabezón (Obras de música para tecla, arpa y vihuela) ont imprimé bon nombre de ses compositions.
